鲤春病毒血症病毒糖蛋白基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据Gen Bank中鲤春病毒血症病毒(SVCV)糖蛋白全基因序列设计特异性引物,以SVCV欧洲株病毒核酸为模板,通过RT-PCR方法获得欧洲株SVCV-G基因,克隆至p PICZαA,构建p PICZαASVCV1540表达质粒。以限制性内切酶Sac I线性化p PICZαASVCV1540后通过化学法转化毕赤酵母感受态细胞X33和GS115,添加1%甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物显示其分子质量为70 ku。Western Blot分析显示该蛋白可以被SVCV山羊多抗识别,表明目的蛋白具有反应原性。     

山羊β-防御素表达载体的构建及产物的活性鉴定

对山羊GBD-1进行载体构建,转到毕赤酵母中高效表达并对表达产物的生物学活性进行鉴定,为进一步研究防御素抗菌机理打下基础。根据GenBank中山羊β-防御素的CDS区序列,设计含有特殊酶切位点的引物扩增到目的片段,将该片段克隆到真核表达载体pPICZαA中,构建重组表达质粒pPICZαA/GBD-1,电转化到毕赤酵母中进行诱导表达。测序结果表明扩增的目的片段为114 bp,编码38个氨基酸,经Tricine-SDS-PAGE电泳验证在4.3 KD处有目的蛋白;作抑菌实验发现,重组蛋白对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑菌效果。山羊防御素成功地在毕赤酵母中诱导表达,为进一步研究GBD-1的蛋白纯化以及抗菌机理打下基础,并为利用基因工程方法生产防御素提供理论依据。     

黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中的高效表达

为高效表达黑曲霉糖化酶基因,根据GenBank中糖化酶的氨基酸序列(登录号:AY652617),选用毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏嗜性,全基因合成新的cDNA序列。改造后的基因克隆到pGAPZαA质粒中,获得重组分泌型酵母表达质粒pGAPZαA-EC,经限制性内切酶Bln Ⅰ酶切线性化后,电击转化入毕赤酵母细胞X33内。经高浓度博莱霉素抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测结果显示,糖化酶基因与毕赤酵母染色体稳定结合。糖化酶蛋白获得分泌表达,SDS-PAGE分析其分子质量约为80 ku,其表达量约为180 mg/L。表达产物经Starch-PAGE活性染色,显示其具有酶学活性。     

重组葡萄糖氧化酶毕赤酵母高产菌株的高通量快速筛选方法

根据葡萄糖氧化酶的反应原理和毕赤酵母诱导表达的机制,本研究建立了葡萄糖氧化酶毕赤酵母表达菌株筛选方法。首先在MM平板中诱导重组子表达葡萄糖氧化酶,然后添加显色液,阳性酵母菌株周围可见显色圈。经过与传统液体培养筛选方法的比较验证,结果表明,该方法灵敏度高,稳定性和重复性好,筛选结果与传统方法一致。当葡萄糖氧化酶活力介于0–0.1 U/ml的范围内,显色圈的绝对面积与酶活力相关系数可达0.63。该平板筛选方法可以从大量毕赤酵母重组子中快速筛选出表达葡萄糖氧化酶的阳性菌株,并可方便地判断出各菌株之间表达水平的差异。同时,该方法也可为筛选其他重组酶毕赤酵母菌株提供参考。     

纤细齿梗孢丝氨酸蛋白酶cDNA克隆及其序列分析和表达

纤细齿梗孢Olpitrichum tenellum是一种寄生在轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides上的活体营养菌寄生真菌。丝氨酸蛋白酶在菌寄生过程可能起到重要作用。根据丝状真菌丝氨酸蛋白酶的同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR及RACE的方法,克隆得到1845bp的全长cDNA片段。其可读框为1554bp（GenBank登录号为EU368754）,编码517个氨基酸的蛋白质。比对分析发现该蛋白是一种分泌型的丝氨酸蛋白酶,属于丝氨酸蛋白酶S8家族的枯草杆菌蛋白酶subtilisin,具有典型的信号肽-前肽-成熟肽的结构。将该基因可读框除去信号肽插入酵母表达载体pPIC9K,转化毕赤酵母Pichia pastoris GS115,在甲醇诱导下成功分泌出具有生物活性的重组蛋白酶,诱导120h后酶活性可达153U/ml。重组蛋白酶经DEAE-Sepharose层析进行纯化,SDS-PAGE分析其分子量为39kD。其反应的最适温度为60℃,最适pH为8。     

牦牛IFN-β基因在毕赤酵母中的分泌表达

用真核表达引物从pGEM-yakIFN-β重组质粒中扩增出牦牛IFN-β基因,将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E.coli的JM109中,得到pPIC9K-yakIFN-β重组表达质粒.通过电击法将经SalⅠ线性化的pPIC9K-yakIFN-β质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,利用甲醇诱导表达,分泌表达产物用MTT法检测其生物学活性.经SDS-PAGE电泳分析表明:表达出约22ku大小分泌于胞外的牦牛IFN-β蛋白分子量,比理论值稍大;MTT结果表明:纯化的重组yak-IFN-β蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性.     

鸡源抗菌肽Folicidin-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物学活性鉴定#br#

【目的】研究鸡源重组抗菌肽Fowlicidin-3的生物学特性,并为重组抗菌肽在临床上的应用奠定基础。【方法】根据抗菌肽数据库中Fowlicidin-3的氨基酸序列,选用毕赤酵母的偏嗜密码子,设计抗菌肽的基因,通过SOE法合成得到全长为114 bp的Fowlicidin-3基因。将Fowlicidin-3基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-F。将线性化重组表达载体pPICZα-A-F通过电击法转入毕赤酵母宿主菌X-33中,构建分泌型重组酵母表达菌株。【结果】获得分泌型重组酵母表达菌株,Fowlicidin-3多肽表达量达到170 mg?L-,对致病性大肠杆菌K99和鸡白痢沙门氏菌显示出较好的抑制活性,抑菌圈直径分别为1.9 cm和2.2 cm。优化表达条件结果显示,转接到BMMY培养基中(pH 6.0),每24 h补加2%甲醇,29℃培养72 h后,Fowlicidin-3抗菌肽获得高效表达。【结论】成功构建分泌型重组酵母表达菌株,并获得了具备高效表达能力和较好生物学活性的抗菌肽。     

猪IL-18在毕赤酵母中分泌表达条件的优化

采用PCR方法从pGEM-IL-18重组质粒中亚克隆出IL-18基因并完成了真核融合表达载体pPIC9K-IL-18的构建和IL-18在毕赤酵母中的表达,在此基础上从发酵时间、不同诱导型、pH值、诱导剂量和接种量等方面对重组基因工程菌的摇瓶发酵条件进行了优化,进一步探索了酵母菌表达猪IL-18的发酵工艺.结果表明,摇瓶发酵时,诱导最佳时间为72 h,甲醇最适浓度为20 g/L,最适pH范围为6.0~8.0,最适接种量1∶1.与单纯甲醇诱导相比,甘油/甲醇诱导后的表达量明显提高.     

岭南黄鸡肌生长抑制素基因成熟肽的克隆及酵母表达质粒的构建

根据Genebank上登录的鸡的myostatin基因cDNA全长序列以及成熟肽序列设计一对引物,并分别在两引物前设计两个酶切位点EcoRⅠ和KpnⅠ,克隆岭南黄鸡肌肉生长抑制激素的成熟肽蛋白编码基因,然后将特异性片段连接到pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定后,构建了岭南黄鸡真核单纯表达载体pPICZαA-MSTN-m,经测序鉴定,结果表明所克隆的myosta-tin成熟肽基因与Genebank上发表的鸡（AF019621）、猪（AY208121）和家鹅（AF440862）的MSTN-m核酸序列同源性分别可达到99%、92%、86%,但翻译后的成熟蛋白氨基酸序列与鸡、猪和家鹅的同源性可以分别达到100%、99.1%及99.1%。     

犬α1干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒活性研究

亚克隆犬α1干扰素(CaIFN-α1)成熟蛋白编码基因并克隆到表达载体pPICZα-A,构建转移重组载体pPICZα-A-CaIFN-α。pPICZα-A-CaIFN-α经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了CaIFN-α1在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE检测结果表明表达产物相对分子质量约为2.7×104,比其推导结果(约1.9×104)大,推测可能是发生了糖基化。酵母分泌表达的CaIFN-α1具有较高的抗病毒活性,约为1.45×106U·mL-1,蛋白含量约为96mg·L-1,比活性为1.49×107U·mg-1。重组CaIFN-α1的生物学活性具有较强的种属特异性,在犬肾细胞(MDCK)上具有很高的抗病毒活性,在鸡胚成纤维细胞上活性较低,而在猫肾细胞(F81)和牛肾细胞(MDBK)上几乎没有抗病毒活性。进一步研究发现,重组犬α1干扰素对犬瘟热病毒和伪狂犬病毒在犬肾细胞中的增殖具有显著抑制作用。